Prover av mummies vävnader under namnen "Maria" och "Vavita" skickades från Peru till ett ryskt laboratorium för forskning. De tillhandahållna proverna av biologiska vävnader studerades med användning av skanningselektronmikroskopi, Ramanspektra, ICPE, och sammansättningen av kiselgur (ett ämne på ytan av huden hos mumier) undersöktes. En studie av DNA från de överförda vävnaderna genomfördes också.
Provberedning
Vävnadsprover på 500 ug överfördes till plaströr och löstes i 1 ml buffert (10 mM Tris-HCl pH = 10,5, 1 mM EDTA, 0,15 M NaCl). Till de resulterande suspensionerna sattes Na-dodecylsulfat till 0,5%, upphettades till +80 ° C, och efter 10 minuter placerades proteinas K (upp till 500 ug / ml) i en termostat (+55 ° C) under 24 timmar.
Deproteinisering utfördes med fenolmetoden: tillsats av fenol i lika stor volym till suspensionen, därefter fenol: kloroform (1: 1), kloroform; efter varje tillsats utfördes konstant omrörning på en vinkelrotor och centrifugering vid 15 tusen varv per minut, 10 min.
Till det supersediment som erhölls efter den 3: e centrifugeringen sattes 1/10 del av volymen av 1 M NaCl och 2,5 volymer två gånger destillerad etylalkohol och lämnades över natten vid -30 ° C i koniska provrör - "Eppendorf". Centrifugering utfördes vid 15 tusen vol. min. inom 10 minuter och fick DNA "utfällt" i form av en brun fällning. DNA-pelleten tvättades två gånger med 70% etylalkohol och torkades vid rumstemperatur (1 h) och löstes sedan i TE-buffert.
PCR utfördes på en programmerbar termisk cykler "My Cycler" ("Bio = Rad") med användning av standardoligoprimerer syntetiserade med fastfasmetoden vid föreningen "Beagler" (St. Petersburg). Reaktionsblandningen för amplifiering med en volym av 25 mikroliter inkluderade: 15 nM av varje oligoprimer, 67 mM Tris-HCI pH = 8,8 vid +25 ° C, 16,6 mM (NH4) SO4, 6,7 mM MgCl2, 6,7 μM EDTA, 10 mM 2 merkaptoetanol, 170 μg / ml BSA och en blandning av fyra basiska dNTP: er i en koncentration av 1,0 mM vardera och termostabilt DNA-polymeras Thermus thermophilis (5 U / mL) (NPO SibEnzim). Efter denaturering (10 min, 94 ° C) utfördes 35 amplifieringscykler för varje testsystem: 94 ° C-1 minut, 58 ° C - 1 min, 72 ° C - 1 min. För att kontrollera specificiteten infördes DNA-prover med kända genotyper för de studerade loci (markörsystem) såväl som kontrollprover i reaktionen.innehållande en blandning av reagens utan DNA. Efter amplifiering tillsattes en färgningsbuffert till alikvoter av reaktionsblandningen (7 ul) och separerades genom vertikal elektrofores i 6% polyakrylamidgel (210x150x1 mm), färgades med etidiumbromid och fotograferades under ultraviolett ljus. För att identifiera alleler användes alleliska standarder motsvarande dessa loci ("stegar").
Kampanjvideo:
DNA-analys
För studien använde vi metoden för exomanalys av humant DNA baserat på sekvensering med hög genomströmning med anrikning genom hybridisering.
Teknik för exomanalys av mänskligt DNA.
2 prover analyserades … Alla steg i provberedningen innan PCR genomfördes i rena rum. Provberedning, DNA-extraktion och amplifiering av individuella DNA-fragment utfördes i olika rum.
Specifika adaptrar (KAPA Library Preparation Kit och SeqCap Adapter Kit; Roche) ligerades till ändarna av det genomiska fragmenterade DNA (~ 5 ng), varefter ett tvåstegs-urval av fragment inom 200-350 bp-längden genomfördes med användning av AMPureXP Beads (Beckman Coulter) … De resulterande fragmenten amplifierades med användning av adapterspecifika primrar och hybridiserades med biotinylerade specifika prober (NimbleGen SeqCap EZ Choice MedExome; Roche) under 28 timmar vid 47 ° C. I en reaktion kombinerades två DNA-prover. Biotinylerade sond-DNA-hybrider isolerades och renades med streptovidinkonjugerade magnetiska partiklar; en andra amplifiering och kvalitativ bedömning av det resulterande DNA-biblioteket utfördes (TapeStation 4200; Agilent Technologies). För att ta bort amplifieringsfragment utanför målet och adapterdimerer renades DNA-biblioteket med användning av AMPureXP Beads magnetiska partiklar (fig. 1). Den slutliga koncentrationen av det beredda biblioteket utvärderades på ett Quantus-instrument med användning av ett kommersiellt QuantiFluor® dsDNA System-kit (Promega). Det resulterande DNA-biblioteket immobiliserades på ytan av flödescellen. Sekvensering utfördes på Illumina-plattformen med användning av en standardflödescell och MiSeq-reagenssats v2 300 (2 x 150 cykler). Det resulterande DNA-biblioteket immobiliserades på ytan av flödescellen. Sekvensering utfördes på Illumina-plattformen med användning av en standardflödescell och MiSeq-reagenssats v2 300 (2 x 150 cykler). Det resulterande DNA-biblioteket immobiliserades på ytan av flödescellen. Sekvensering utfördes på Illumina-plattformen med användning av en standardflödescell och MiSeq-reagenssats v2 300 (2 x 150 cykler).
Figur: 1
Allmän bedömning av kvaliteten på sekvenserat DNA
Standardmetoder som FastQC och Jellyfish och KraTER-programmen användes för den första kvalitetsbedömningen. Kvalitetsbedömningen visade inga kvalitetsproblem med den sekvenserade DNA-avläsningen för båda proverna. Bilder visas inte eftersom de inte är informativa.
För det första provet (ytterligare M, stor mumie "Maria") sekvenserades 113,4 M läsningar, för det andra provet (ytterligare W, liten mamma "WaWita") sekvenserades 22,9 M läsningar.
Nästa steg var att rena de sekvenserade läsningarna från olika tekniska sekvenser som skulle störa vidare analys. För detta användes Cookiecutter-programmet. Efter rengöring fanns 113,3 M (99%) avläsningar respektive 22,8 M (99%) läsningar för M respektive W.
Uppskattning av mängden forntida DNA och dess separering från modernt
Standardmetoden för att bedöma närvaron och mängden forntida DNA är att uppskatta mängden tidsskadade nukleotider. För detta användes MapDamage 2.0-programmet. MapDamage 2.0 som visade mängden forntida DNA i 30,1%, men eftersom MapDamage antyder att vi använder en nära referens, och vi vet inte exakt hur nära båda proverna är moderna människors genom, och vi använde ett exome-bibliotek, var denna metod i sig inte tillräcklig. En annan bra metod för bedömning av forntida DNA är antalet korta fragment.
Filtrering av det påstådda forntida DNA skedde i tre stadier. I det första steget tog vi bort alla parade läsningar som inte kan korsas och monteras i en oparad läsning med en överlappning. Dessa läsningar indikerade att det ursprungliga fragmentet som sekvenserades var längre än 300 bp. och troligen modernt DNA. Så efter detta steg var 86,9% respektive 91,8% kvar. Därefter valdes enskilda överlappande fragment så att deras längd var kortare än 150 bp, eftersom detta är den längd som vi förväntade oss för antika DNA. Efter detta steg återstod 8,6% respektive 38,5% för proverna M och W. Det bör noteras att trots skillnaden i procent är det absoluta antalet läsningar mellan proverna M och W mycket lika: 9,8M och 8,8M, vilket kan förklaras med det faktum att innehållet av forntida DNA i båda proverna är lika.
| Parameter | Prov M (Maria) | Prov W (Wawita) |
| Antal läsningar | 113.3M | 22.8M |
| Procentandel av korta fragment <300 bp | 86,9% | 91,8% |
|
Procentandel av korta fragment <150 bp (antal) |
8,6% (9 846 035) |
38,5% (8 813 220) |
|
Procentdel av fragment i linje med humant genom (antal) |
2,03% (2,345,084) |
9,65% (2 264 551) |
| Procentandel fragment i linje med humant genom från kort <150 bp | 23,8% | 25,6% |
Få DNA som liknar referensmänskligt genom
Det resulterande antagna antika DNA: et mappades till ett referensmänskligt genom genom användning av en standardgenomisk variant-sökledning med användning av BWA, samtools och Wcftools.
Dessutom mappades endast 23,8% av provet M och 25,6% framgångsrikt till referensgenomet för moderna människor. För båda proverna kunde 75% av de sekvenserade läsarna inte kartläggas på det mänskliga genomet. Detta kan förklaras både genom kontaminering och genom att dessa prover är placerade tillräckligt långt ifrån moderna människors genom. Samtidigt är det värt att komma ihåg att vi har sekvenserat exome-biblioteket och därmed minimerat föroreningen av bakterie-DNA.
Inledande rekognoseringsanalys av okokta läsningar visade att några av dem tillhörde repetitivt DNA specifikt för hovdjur, detta kan förklaras av det faktum att lamafett användes vid mumifiering.
En mer detaljerad analys kräver cirka tre veckors beräkningar, eftersom de befintliga lösningarna endast gjordes för virala och bakteriella genomer, och vi måste jämföra med alla befintliga genom, inklusive växtgenom, för att förstå vilka arter som sekvenserades.
Egenskaper för de hittade alternativen
De kartlagda läsarna användes för att söka efter varianter som skiljer M- och W-prover från det moderna mänskliga genomet, samt för att bedöma kontaminering av läsningar från det mänskliga Y-kromosomet.
Den första frågan som behövde besvaras var vilka kromosomer de sekvenserade läserna mappades till.
Eftersom vi vet att Marias prover isolerades från ben och muskler, och Vavita endast från ben, förväntade vi oss en skillnad i mängden mtDNA. Men det var inte mycket skillnad.
Antalet kartlagda läsningar på Y är ytterligare ett test för kontaminering av moderna människor. Intressant nog visade det sig vara detsamma i båda proverna.
Statistiken för de hittade varianterna visas nedan:
| parametrar | Prov M (Maria) | Prov W (Wawita) |
| Antal hittade alternativ | 79.957 | 48.941 |
| Antal alternativ på Y | 534 | 541 |
| Antalet pålitliga alternativ (mer än 20 läsningar och mer än 30 kvalitet) | 16969 | 6181 |
| Varianter med känd rsid (finns i snipdatabasen) | 5701 | 3089 |
| Allmänna giltiga alternativ | 92 | |
| vanliga alternativ med rsid | 49 |
Efter det blev det möjligt att svara på frågan: är M- och W-släktingar? Svaret är nej.
Endast 49 matchande varianter hittades mellan M och W och 3040 skilde sig åt för varianter med känd rsid. Dessutom är det kanske dessa olika typer eller underarter av en person eller en okänd varelse.
Intressant nog är varianterna med Y-kromosomen identiska för båda proverna, vilket indikerar kontaminering av samma person, och att det i antikens DNA från Y-kromosomen förmodligen inte finns någon kromosom.
Utvärdering av likheten med de befintliga sekvenserade humana genomen från 1000 Human Genome Project
Observera att detta endast är en ungefärlig analys, eftersom för en mer exakt analys behövs varianter från regioner i genomet under neutralt urval, och vi har exomdata.
Men med användning av 5708 varianter för M eller 3096 för S var det möjligt att utföra en variant av analysen jämfört med data från 1000 humana genom.
Resultatet av PCA-analysen på bilden nedan är en överläggning av två bilder för M och W, beräknade separat, eftersom det finns för få vanliga alternativ mellan M och W för att uppskatta avståndet mellan M och W.
Likhetspoäng.
Som ni kan se finns det ingen slump med någon grupp av gener, de skiljer sig också från varandra. Men det bör komma ihåg att vi använde kodningssekvenser under urval, och det rekommenderas att använda varianter under neutralt urval.
PCA-resultatet är dock i god överensstämmelse med manuell verifiering av varianter, vilket visade att uppgifterna finns i en oreferenserad homozygot, vilket återigen indikerar att bilderna är långt ifrån det moderna mänskliga genomet.
Slutsats
Tyvärr var vi begränsade till endast två prover, vanligtvis används i denna typ av analyser, minst 3-10 åtminstone på något sätt relaterade. Därför är det nödvändigt att fortsätta forskning med ett stort antal prover.
Samtidigt kan vi troligtvis dra slutsatsen att DNA-proverna av Mary och Vavita motsvarar mänskligt DNA, men inte sammanfaller med det DNA som finns tillgängligt från databasen med 1000 personer.
Författarna till rapporten: Baranov V. S. och Aseev M. V. (Scientific Research Institute of Obstetrics and Gynecology, Department of Prenatal Diagnostics), Glotov A. S. och Glotov O. S. (St Petersburg State University), A. S. Komissarov (Institute of Cytology, Russian Academy of Sciences, Center for Genetic Bioinformatics).
Material som tillhandahålls av Konstantin Georgievich Korotkov (doktor för tekniska vetenskaper, professor, universitet för informationsteknologi, mekanik och optik) och Dmitry Vladislavovich Galetsky (kandidat för medicinska vetenskaper, I. P. Pavlov första St Petersburg State Medical University).
För mer information om Nazca mumier, se taggen: Nazca mumier.
