EGenesis, som är specialiserat på produktion av genetiskt modifierade svin för transplantation av mänskliga organ, har meddelat födelse av flera redigerade djur. De förlorade tre gener, förvärvade nio och förlorade också 25 virus som multiplicerade i genomet. Samtidigt är svin helt friska och bördiga, och deras celler orsakar inte aggression i komponenterna i det mänskliga immunsystemet. Mänskliga kliniska studier av transplantationer planeras under de kommande åren. En förtryck av verket publiceras på bioRxiv-portalen.
Det finns tre hinder för transplantation av mänskliga organ. Den första är fysiologisk kompatibilitet: organet måste vara lämpligt i storlek, struktur och funktion. I detta avseende är ett bekvämt föremål ett gris, av vilka många av organen - till exempel hjärtat eller njurarna - inte skiljer sig väsentligt från de mänskliga.
Det andra hindret är immunavstötning. Människokroppen reagerar försiktigt på eventuella okända molekyler, men vissa - till exempel socker på ytan av främmande celler - orsakar särskilt stark aggression.
Slutligen är det tredje virusen som varje organisme bär i sitt genom. Vi talar inte om aktiva virus som orsakar epidemier, utan om endogena virus, det vill säga de som inte dödar cellen utan bara multiplicerar inom dess kärna. Men om cellen fortfarande på något sätt håller sina egna virus under kontroll, om främmande celler infekterar den med nya virus, kanske den inte kan hantera konsekvenserna av deras reproduktion.
För att ett grisorgan ska bli kompatibelt med människor, med beaktande av alla dessa krav, är det nödvändigt att göra ändringar samtidigt i ett antal gener. Till att börja med försökte de uppnå detta genom genutsläpp, och hjärtat av en gris med flera knockouts varade i babianens kropp i tre hela år.
Men 2015 grundade den amerikanska genetikern George Church och den kinesiska biologen Luhan Yang eGenesis, ett företag vars mål var att skapa svin modifierade av flera gener på en gång. Efter ett tag rapporterade forskare under ledning av kyrkan att de kunde rensa grisceller helt från endogena retrovirus. Nu har Church och Jan tagit nästa steg: att skapa både "virusfria" och immunologiskt kompatibla djur.
För att göra detta var forskarna vid eGenesis tvungna att utveckla ett flerstegsprotokoll. Till att börja med tog de en kultur med fibroblaster från örat på ett vanligt gris. Med hjälp av elektroporering infördes molekyler i CRISPR / Cas9-systemet i dem för att skära ut tre gener från DNA som orsakar den starkaste avvisningen i människokroppen. Samtidigt infördes en plasmid med nio nya, redan mänskliga gener i cellerna, som ansvarar för att undertrycka immunsvaret och blodkoagulationsprocesser. Således bör de resulterande cellerna inte bara inte orsaka immunagression, utan också undertrycka den.
Efter att ha bekräftat att redigeringen var framgångsrik, tog forskarna bort fibroblastkärnorna och placerade dem i kärnfria ägg - en länge etablerad metod för kloning. Embryon utvecklades från äggen, som planterades hos surrogatmödrar, som födde smågrisar från den första generationen. Dessa grisar hade fortfarande virus, men de borde redan ha visat sig vara immunologiskt kompatibla med människor.
Kampanjvideo:
Forskare isolerade igen en kultur med fibroblaster från kroppen och genomförde nästa steg i redigering i den: igen, med elektroporering, introducerades CRISPR / Cas9-systemet i cellerna, som attackerade den omvända transkriptasgenen, ett nyckelenzym med vilket endogena virus reproduceras i genomet. Därefter isolerades cellkärnorna också, placerades inuti oocyterna och andra generationens smågrisar erhölls. Grisarna förlorade alltså tre gener, fick nio och förlorade också tjugofem aktivt multiplicerande virus.
Forskarna verifierade att de redigerade grisarna var genetiskt stabila. I deras celler uttrycktes faktiskt åtta av nio mänskliga gener och gener som orsakar immunavstötning var "tyst". Forskare kontrollerade djurgenomet för spår av redigering utanför målet och fann flera CRISPR / Cas9 "missar", men de påverkade inte de proteinkodande regionerna i DNA.
Djuren var själva fysiologiskt friska och bördiga. Trots att de störde deras immunitet och blodkoagulationssystem var deras blodantal inom normala gränser. Forskare fann inte heller någon effekt av redigering på hjärtat, levern och njurarna hos grisar.
Slutligen testade forskarna huruvida de genetiskt redigerade grisarna hade förvärvat de egenskaper som krävs för transplantation. Först isolerade de en cellkultur från kärlväggarna hos grisar och behandlade den med humana immunoglobuliner: de binder till modifierade celler 90 procent mindre än normala. Sedan agerades dessa celler av humana komplementproteiner - de reagerar på närvaron av främmande celler ännu tidigare än immunoglobuliner - men komplementsystemet aktiverades inte oftare än för deras egna, humana celler.
Således har forskare lyckats skapa djur vars celler inte orsakar omedelbar aggression av människans immunitet. Trots det faktum att immunsystemet kan reagera på främmande celler senare och känna igen dem sällsynta proteiner, kan detta hanteras med hjälp av immunsuppressiva medel. Redigering, å andra sidan, gör att du kan undvika akut avstötning och få tid för organet att slå rot i kroppen. I en intervju med Science klargav Yang att företaget planerar att fokusera på prekliniska tester år 2020, men förväntar sig att flytta till mänsklig forskning under de kommande fem åren.
Författare: Polina Loseva