Uppfinningen av CRISPR-Cas-genredigeraren kallas en revolution inom biologi. Forskare lovar att använda den för att förbättra växtsorter och djurraser för jordbruk, för att behandla medfödda genetiska sjukdomar hos människor. RIA Novosti-korrespondenten gick för att se vem och hur genomet redigeras.
Genome Editing Center vid Moskva State University öppnade för drygt ett år sedan - på campus. Jag träffas av dess chef, doktorn i kemi Peter Sergiev, och medan vi åker i hissen ägnar han sig lite åt historien om genteknik.
”Genomet har redigerats tidigare. Men det var svårt att skapa verktyg för det, det tog lång tid och resultatet var ofta inte som vi ville ha det, säger han.
I vivariumet byter Pyotr Vladimirovich till blå laboratoriekläder, de ger mig en vit overaller för engångsbruk och ber mig torka av kameran med alkohol. Nu ser Petr Vladimirovich ut som en kirurg, och jag - som en laboratorieassistent från serien "CSI - Crime Scene".
I det sterila laboratoriet har en behållare med befruktade musägg och ett provrör med RNA-lösning förberetts för oss. Det är allt du behöver för CRISPR-Cas genomredigering.
CRISPR är en engelsk akronym för en fras som bokstavligen betyder "regelbundet grupperade korala palindromiska upprepningar." I själva verket är det bara små delar av DNA: t från bakteriofagvirus inbäddade i bakteriegenomet. Dessa sekvenser behövs för att det bakteriella immunsystemet ska fungera och tjäna som ett slags "polis-önskat" meddelande. Om bakterien överlever efter att ha infekterats med en bakteriofag, använder den Cas-proteinenzymerna för att skära en bit av dess DNA och infoga den i sitt genom för att igenkännas senare. Bakteriegenomet ärver detta bibliotek av "fiender" som noggrant samlats in av tidigare generationer.
2013 fann forskare att Cas-proteinet fungerar i alla organismer, inklusive däggdjur. Han kan göra riktningsavbrott i båda strängarna i DNA-molekylen och därmed förändra genomet.
Kampanjvideo:
Äggmanipulation
Petr Sergiev gör ett glaskapillär med en diameter på hundra mikron vid mikrosmeden, drar ägget in i det och överför det under glas med ett näringsmedium. Det färdiga provet skickas till scenen för det optiska mikroskopet. Monitorn visar en förstorad bild av ägget, som dirrade vid spetsen av kapillären. Två avrundade fläckar sticker ut - det här är pronuklei med DNA från mor och far.
Forskaren förbereder en ny kapillär med en storleksordning mindre i diameter. Detta är en injektionsspruta. Den samlar in en lösning med två typer av RNA i den och med hjälp av manipulatorer sticker man ägget försiktigt. Det är det, injektionen är klar.
RNA som injiceras i ägget behövs för att skära genomet på en given plats. En typ av RNA innehåller en strikt definierad sekvens av nukleotider, liknande den som vi tänkte ändra. Detta RNA: s uppgift är att hitta motsvarande region i DNA, därför kallas det "guide". RNA av den andra typen, matris, är en typ av instruktioner för syntes av Cas9-nukleasproteinet. Detta protein fungerar som en katalysator för en kemisk reaktion som bryter fosfodiesterbindningar mellan väldefinierade DNA-baser. Eftersom proteinmolekylen har två nukleascentra öppnas båda DNA-strängarna, dessutom på platsen, vilka koordinater som Cas9 "räknade" med styr-RNA.
DNA-molekylen uppfattar brottet i båda strängarna som en allvarlig nedbrytning och försöker reparera den. Exonukleasenzymer som flyter i cellen avlägsnar omedelbart flera nukleotider från båda ändarna av brottet. Detta räcker för att bryta, eller, som genetiker säger, "stänga av" en gen.
Så fungerar genomisk redaktör CRISPR-Cas9 / Illustration av RIA Novosti. Alina Polyanina.
Om en riktad mutation behövs, till exempel, det krävs att markera ett protein för att spåra det i kroppen, läggs en annan mall till komplexet till två RNA i form av ett speciellt utformat DNA. Det består av sekvenser som är identiska med kanterna på det framtida avbrottet och innehåller också det avsnitt som ska infogas. Efter att Cas9 har klippt DNA-molekylen ansluts dess ändar med denna ytterligare mall, så den uppsättning nukleotider som vi behöver sätts in i brytningen.
”Vi kan fästa en liten svans i ekorren, vilket gör det bekvämt att dra ut den och se vad den interagerar med. Vi kan infoga en gen, men den är inte lika effektiv som att stänga av den, fortsätter forskaren att förklara.
GMO och chimärer
Det redigerade ägget kommer att transplanteras i uterusröret hos en surrogatmus. Hon bodde under en tid med en hane vars seminiferösa tubuli var bundna. Paret hade ett normalt sexliv, men kunde inte bli gravid. Trots detta trodde musens kropp att hon var gravid och bildade lämplig hormonell bakgrund för henne. Nu bär den här kvinnan någon annans foster.
Om tre veckor kommer hon att föda de vanligaste mössen. Forskare kommer att vänta tills gnagarna växer upp, tar en liten bit av svansen från dem och använder PCR för att analysera den DNA-bit som de redigerade. En mutation eller en funktionshindrad gen finns i mer än hälften av fallen. Den omvända proceduren - införande av en sekvens i genomet - lyckas med högst 10% av experimenten.
Olika intressanta effekter visas vid redigering. Till exempel födas mosaikmöss eller kimärer, som har celler med olika variationer av moder- och fostergenomen. Cas9 kan klippa DNA många gånger, men budbärarens RNA som kodar för det är inte evigt, och den injicerade lösningen försvinner helt enkelt i en serie celldelningar. Ibland skjuter redaktören fortfarande igen efter att kärnorna har smält och ägget delat. Och eftersom DNA-reparation efter en bristning alltid är en slumpmässig process och läkning aldrig sker på samma sätt, kommer några av cellerna i en organisme att innehålla en annan mutation.
För vetenskap och medicin
Vi flyttar in i det intilliggande rummet för att se de direkta resultaten av genom-redigeringsexperimenten. På hyllorna till vänster - behållare med genetiskt modifierade möss, till höger - med vanliga gnagare för kontroll. De odlades, som de till vänster, men genomet manipulerades inte. Kontrollmöss behövs för att ha en norm framför våra ögon och jämföra varelserna som erhållits i experimentet med det.
Pyotr Sergiev tar en av behållarna med ett par grå möss. Utåt är de helt vanliga, men de har inte avkom. Faktum är att hos hanen är genen från en av RNA-metyltransferaser, ett enzym som endast produceras i spermier, avstängd. Hanar med en inaktiv gen föds sterila. Det exakta syftet med genen och enzymet är fortfarande okänt. För att ta reda på det avlades två mössstammar i laboratoriet: en hade en gen avstängd, den andra hade ett protein märkt med en genomisk redaktör.
”En mutation i denna gen finns också hos människor - då lider en man av infertilitet. Men tills vi tar reda på varför det behövs, varför det modifierar RNA, kommer vi inte att kunna hjälpa sådana patienter,”säger forskaren.
Vi vet faktiskt fortfarande inte funktionen hos de flesta mänskliga gener. Att ta reda på detta är en grundläggande uppgift som löses av många forskargrupper runt om i världen, inklusive i Ryssland. Musgenomet är mycket likt det hos människor. Man hoppas att med hjälp av CRISPR-Cas kommer studiet av arv från någon varelse att gå snabbare.
Sergievs grupp tillsammans med N. N. NN Petrova började leta efter mutationer som leder till vissa typer av cancer. De närmaste planerna inkluderar ett projekt för att skapa genetiskt modifierade djur för jordbruk i samarbete med All-Russian Research Institute of Animal Husry and the Institute of Gene Biology of the Russian Academy of Sciences.
”CRISPR-Cas är ett fantastiskt verktyg som låter dig ändra genomet efter eget gottfinnande, att vara en liten bit av Gud. I slutändan är vetenskapens uppgift att förstå hur en så komplex varelse som ett däggdjur fungerar, säger forskaren.
Att lösa grundläggande vetenskapsproblem är stort, men vad kommer tekniken att ge medicin? Under överskådlig framtid, tyvärr, inte mycket. Det är lätt att redigera ett ägg och ta upp en genetiskt modifierad mus, men det är omöjligt att korrigera generna hos ett vuxet djur, än mindre en människa.
Metoder för att redigera DNA i somatiska (det vill säga redan bildade celler) är fortfarande mycket ineffektiva. För att införa en gen avstängd genom mutation i en cell och tvinga den att producera ett visst protein, måste du ta bort några av cellerna från kroppen, redigera DNA i dem och sätta tillbaka det i kroppen. I princip finns det hopp om att det på detta sätt blir möjligt att bekämpa sjukdomar som Duchenne muskeldystrofi eller cystisk fibros, när det är nödvändigt att återställa arbetsförmågan hos någon del av cellerna. När det gäller predispositionen för cancer är den genomiska redaktören hittills maktlös. Om en mutant gen finns i en person, hittas den i alla kroppens celler. Det är orealistiskt att ändra dem alla. Och varje cell med en mutation är en källa till fara.
Men även om CRISPR / Cas kommer att hjälpa till att svara bara på några grundläggande frågor och tillåta behandling av sällsynta genetiska sjukdomar, kommer det fortfarande att vara ett stort steg framåt för mänskligheten.
Tatiana Pichugina