Optogenetics är en metod för att studera exciterbara celler som använder proteiner som är inbäddade i cellmembranet och aktiveras av ljus (därmed "opto"). Sådana proteiner (opsins) finns i de flesta djur i näthinnan i ögonen, liksom i vissa växter, till exempel i gröna alger. För att integrera fotoaktiverade proteiner i neuronmembran är det nödvändigt att införa rhodopsin-gener erhållna från andra organismer i neuroner, därav "genetiken". 2015 firade optogenetik sitt tioårsdag. Under denna tid har ett effektivt verktyg för att studera nervsystemet blivit starkare och fått ett antal applikationer som ursprungligen inte var tillgängliga.
Hjärnan och dess element
Medvetande, personlighet, intelligens - allt detta skapas av nervceller. Detta innebär att om vi vill studera dessa aspekter av människans (och inte bara) varelse, måste vi definitivt förstå vad som händer med nervcellerna i studieobjektet. Huvudproblemet är att det finns för många av dessa nervceller och det är omöjligt att hålla reda på alla neuroner på en gång. Dessutom tenderar nervceller att bilda kluster, så det är problematiskt att skilja verkan från en neuron från en annan och att agera på varje cell separat i de flesta fall. Det finns två vägar ur detta: att acceptera och registrera aktiviteten hos grupper av celler, få en slags "medeltemperatur på sjukhuset", eller fortfarande försöka undersöka en neuron, om möjligt - mycket nödvändigt och viktigt för kroppen. Den första används oftare i studier av däggdjurshjärnan,den andra - på enkla nervsystem (till exempel övervakar de den elektriska aktiviteten hos stora "kommandoneroner" av det defensiva beteendet hos en druvsnigel eller celler från havsgroprop alysia liknande egenskaper). Blötdjur, maskar och fruktflugor med sina relativt små nervsystem är naturligtvis bra, men de är väldigt långt ifrån människor. Jag skulle vilja utforska någon vars hjärna är närmare vår struktur och därför oftare välja den första metoden.vars hjärna är närmare vår struktur och därför väljs den första metoden oftare.vars hjärna är närmare vår struktur och därför väljs den första metoden oftare.
Det finns många metoder för att studera nervsystemet, men de är nästan alltid inte särskilt exakta. Det finns funktionell magnetisk resonansavbildning, som inte tillåter att se enskilda celler och endast känner igen relativt långsamma processer (förändringar i blodtillförseln i hjärnkärlen). Det finns elektroencefalografi, det är snabbare, men det skiljer inte heller mellan enskilda neuroner och liknar att försöka spela in något läsbart genom att hänga en mikrofon över en fotbollsplan mitt i en match. Slutligen kan fluorescerande färgämnen användas som ändrar färg som svar på förändringar i koncentrationen av vissa joner i cellen eller till deras totala laddning (det vill säga till neuronens membranpotential). Dessa färgämnen verkar ganska långsamt. Deras temporära upplösning (responstid) är inte tillräckligt hög för att upptäcka och "visa" en separat handlingspotential i en neuron. Mer exakt,detta betraktades fram till en nyligen publicerad, vars författare fortfarande kunde göra detta (Science, 2015, 350, 6266: 1361–1366, doi: 10.1126 / science.aab0810).
Med ett ord är det inte så lätt att registrera aktiviteten för en enda cell utan att påverka angränsande neuroner. Det är ännu svårare att specifikt modifiera denna aktivitet. Du kan injicera i hjärnans farmakologiska läkemedel som endast verkar på celler med vissa egenskaper, sedan titta på dessa celler under ett mikroskop eller göra ett avsnitt av ett djurhjärna och registrera dess elektriska aktivitet med mikroelektroder. Men för att få ett sådant läkemedel måste djuret dödas. Även om vi lägger synd åt djur och mänskliga överväganden, måste det medges att sådana experiment är extremt slöseri. För att ta reda på hur signalerna från ett litet antal celler har förändrats måste du växa en hel hjärna, mata den och ta hand om den, och efter att ha preparerat läkemedlet kan den användas i en och en halv timme, sällan längre.
Ett annat alternativ är att stimulera enskilda nervceller med elektriska signaler av artificiellt ursprung, driva dessa signaler längs motsvarande nerv eller vattna celler med neurotransmittorer inom ramen för en konstgjord synapsmodell. Men för detta måste du först hitta lämpliga celler, och detta är inte en triviell uppgift.
Slutligen finns det en metod för konstgjord frisättning av glutamat från synaptiska vesiklar under påverkan av ultraviolett strålning (denna metod kallas också glutamat uncaging). I själva verket imiterar ljuset i detta fall handlingen av en exciterande signal som anländer till cellen, vilket utlöser frisättningen av en neurotransmitter vid synapsen. Detta är ett mycket exakt och effektivt verktyg, men det har också en nackdel. Genom verkan av ultraviolett strålning kan de nu bara släppa glutamat, men inte alla neuroner utsöndrar det och inte någon annan signalbärare. Dessutom aktiverar inte den konstgjorda frisättningen av glutamat målneuronet lika starkt som elektrisk stimulering längs nerven, och det är problematiskt att göra cellutgångsåtgärderna i detta fall.
Kampanjvideo:
Från alger till neuron
Sedan 2005 har den subtila manipuleringen av neural aktivitet blivit möjlig, och detta har hjälpt av fotoaktiverade ämnen som kan fånga ljuskvanta och svara på dem. Vissa av dem har varit kända länge sedan början av 1970-talet, men de lärde sig bara att tillämpas i neurobiologisk forskning i mitten av 2000-talet.
Den encelliga algen Chlamydomonas reinhardtii har ett protein som heter chanelrodopsin-2 (ChR2). Från namnet är det tydligt att det är en släkting till rodopsin av näthinnestavar. Liksom ögonpigmentet reagerar chanelrodopsin på lätt bestrålning, bara på något annorlunda sätt: det ökar tillströmningen av positiva joner till algcellen. Detta påverkar dess membranpotential (vilopotential): inom tusendels sekund närmar sig den noll från en medvetet negativ; experter säger: "cellen är depolariserad." I detta fall genererar inte Chlamydomonas-cellen handlingspotentialer, men det skulle vara teoretiskt möjligt: elektriska signaler som liknar handlingspotentialer kan också uppstå i växtceller (Plant, Cell and Environment, 2007, 30, 249–257, doi: 10.1111 / j. 1365-3040.2006.01614.x).
När chanelrodopsin-2-genen isolerades från Chlamydomonas och klonades, blev dess nukleotidsekvens känd för flera forskarteam, inklusive Karl Deisseroths laboratorium vid Stanford University. Denna händelse visade sig vara avgörande för optogenetikens födelse. Medan andra team började aktivt studera mångfalden av kanaler, spelade chefen för detta laboratorium, en neurofysiolog och även en psykiater (förmodligen, det praktiska tänkandet hos doktorn Deisseroth spelade en viktig roll i valet av studieobjekt), märkt något som är värd att tillämpas i ChR2. Eftersom vi har ett protein som kan förändra membranpotentialen för en cell, och vi har dess gen, varför inte sätta in denna gen i en elektriskt exciterbar cell och se vad som händer?
Inte sade tidigare än gjort. Genen för chanelrodopsin-2 var bunden till en promotor (en DNA-sekvens som indikerar för RNA-polymeras att nästa sektion av molekylen bör läsas och tillverkas av dess mRNA-prov), infogades i viruset och viruset injicerades med en fin nål i mushjärnan. Vi behöver bara kontrollera var exakt de virala partiklarna fick, om vi missade injektionsstället. För att förstå detta, utöver genen för det ljuskänsliga proteinet, är det nödvändigt att införa genen från ett reporterämne i neuronet - detta ämne kommer att indikera närvaron av chanelrodopsin. En bekväm reporter är ett fluorescerande protein, eftersom fluorescens i celler är synlig både på skivor i hjärnan, och - med tillräcklig koncentration - även utanför kroppen. ChR2-genen och reportergenen (till exempel det gula fluorescerande proteinet YFP) är under samma promotor, så de uttrycks tillsammans,och båda proteinerna produceras i cellen på samma gång. Om det finns chanelrodopsin i cellen, fluorescerar det.
Nästan allt är klart, allt som återstår är att bygga en ljuskälla in i hjärnan, som kommer att aktivera cellerna som bär chanelrodopsin. Denna källa är vanligtvis en miniatyr fiberoptisk LED som producerar ljus med en våglängd på cirka 480 nm (blå). Det är på denna strålning som ChR2 svarar mest effektivt. Fiberen injiceras i det önskade området i hjärnan och fixeras med en speciell kanyl på skallens yta (fig. 1). Ett djur kan bära en sådan anordning under mycket lång tid, och för att registrera aktiviteten i dess celler behöver det inte dödas. Och detta är bra både ur etikens synvinkel och från praktiken. Under ett optogenetiskt experiment kan den experimentella varelsen röra sig fritt, och dess beteende kommer säkert att vara närmare naturliga än om samma neuroner studeras i hjärnskivor eller i ett djur.fixerad i stereotaxis under anestesi.
Figur: 1. Allmänt schema för att införa en fotoaktiverad kanal i neuroner.
Ljuskällan ensam räcker inte för att genomföra ett komplett experiment. Vi kan inte berätta hur de "experimentella" neuronerna reagerade på fotostimulering förrän vi bekräftar uppkomsten av elektriska signaler som svar på exponering för ljus. Därför, parallellt med instrumentet för att aktivera neuronet, behövs ett medel för att registrera dess aktivitet, så att mikroelektroder implanteras i hjärnan tillsammans med ljuskällan. Med hjälp av dessa mikroelektroder bekräftade Deisserot och kollegor i praktiken att med hjälp av chanelrodopsin är det möjligt att ändra cellens membranpotential kraftigt och snabbt, fram till genereringen av handlingspotentialer, och beskrev resultaten i artikeln (Nature Neuroscience, 2005, 8, 1263-1268, doi: 10.1038 / nn1525). Optogenetikens era började med detta arbete.
Omkopplare, omkopplare och andra
Channelrodopsin är inte den enda fotoaktiverade kanalen för optogenetik. Det finns också halorhodopsin (HR, fig. 2), ett archeaealt protein som, när det aktiveras av gult ljus, släpper in negativt laddade klorjoner (och inte positiva natrium- och kaliumjoner, som i fallet med cannelrodopsin). Detta leder till hyperpolarisering av cellmembranet: potentialskillnaden på den blir mer negativ än i vila, och cellen, som tidigare lätt gav ut handlingspotentialer, "blir tyst" när halorhodopsin aktiveras.
Figur: 2. Arbetsschema för halorhodopsin. Medan denna kanal är aktiv är det svårare för cellen att generera handlingspotentialer.
Halorhodopsin- och chanelrodopsin-gener kan sättas in i samma cell, eller de kan införas i olika. Två fotoaktiverade kanaler med olika egenskaper är bättre än en. Men det är inte allt (fig. 3). Det finns också bakteriorhodopsin (BR) och protorhodopsin (PR). Liksom kanaldrodopsin öppnar de vägen för positivt laddade joner, men inte för några, utan bara för vätejoner - protoner. Och effekten är motsatsen till chanelrodopsin: protoner kommer inte in i cellen utan lämnar den, på grund av att membranet hyperpolariserar och cellens förmåga att excitera förloras.
Figur: 3. Variationer av fotoaktiverade kanaler som används i optogenetik.
Det finns också exotiska djuropiner under det allmänna namnet Opto-XR. Dessa är inte jonkanaler, men hybrider av rhodopsin i näthinnekottarna hos däggdjur och vissa receptorer kopplade till G-proteiner (G-proteiner använder omvandlingen av nukleotidens BNP till GTP och utlöser många signalprocesser i celler). I synnerhet bär Opto-XR-serien fragment av adrenerga receptorer, och en ovanlig art består av en del av råttorodopsin och en del av serotonin-typ 1A-receptorn. Naturligtvis, utan att vara kanaler, kan Opto-XR naturligtvis inte tillhandahålla en handlingspotential, men deras aktivering efterliknar aktiveringen av receptorer, delar som de bär i sig själva. Med andra ord, efter exponering för Rh-CT (5-HT1A) kommer cellen att fungera som om serotonin hade kommit till dess synapser. Det har visats att sådana hybridproteiner är belägna på neuronmembran ungefär på samma plats,var är de verkliga receptorerna för liknande neurotransmittorer. Därför kan de användas för att studera olika signalöverföringssystem i hjärnan, utan rädsla för att få resultat som är långt ifrån verkligheten.
På senare tid beskrev forskare vid University of Texas School of Medicine en hel familj av nya algodder som leder negativt laddade joner i celler. De svarar på fotostimulering snabbare än de rodopsiner som redan används i optogenetik och kräver mindre ljus för aktivering (Science, 2015, 349, 6248, 647-650, doi: 10.1126 / science. Aaa7484). Kanske har de en stor framtid.
Optogenetik och beteende
Men tillräckligt med neurofysiologisk teori, det är dags att gå vidare till träning. Beteende beror på sekvenserna av nervsignaler som visas vid rätt tidpunkt på rätt plats. Det visar sig att genom att känna till tid, plats och sekvens för dessa signaler kan vi återskapa den önskade formen av beteende och få den saknade informationen om strukturerna genom vilka detta beteende manifesteras.
En intressant studie om detta ämne publicerades nyligen i Nature (2015, 519, 233-236, doi: 10.1038 / nature14024). Även om optogenetiska tekniker ursprungligen testades på gnagare, förbjuder ingenting att göra detsamma på andra modellobjekt, till exempel på Drosophila. Naturligtvis kommer detta att kräva något modifiering av tekniken, eftersom insekts neurofysiologi skiljer sig från neurofysiologin hos däggdjur.
Drosophila, som människor, påverkas av en lång vistelse i nära kluster av sitt eget slag, med andra ord i en mängd. Med andra ord är de också föremål för besättningar. Det är känt att koldioxid för fruktflugor har en mycket obehaglig lukt. En ensam fluga som luktar CO2 flyger långsamt till där luften är frisk. Om detta insekt befann sig i en flock, drar andra sig snabbt bakom det. Även om bland hundra flugor, bara hälften kan lukta, och resten blockeras av lukt, kommer hela hundra att röra sig bort från stanken. Denna synkronitet uppnås konstigt inte genom luktkänslan. Undvikelsesreaktionen i detta fall är kollektiv: vissa flugor skickar signaler till andra om behovet av att flytta sig från källan till koldioxid. Insekter överför samtalet för att fly genom att röra varandra. Dessutom, i flugor,mottagning av en signal aktiveras mekanosensoriska nervceller vid benens spetsar. För att bevisa detta användes flera metoder, inklusive optogenetik. Speciellt i ett av experimenten aktiverades mekanosensoriska neuroner i spetsarna av deras tassar med ChR2 inbäddade i celler optogentiskt i flugor i en atmosfär med ett normalt (inte överdrivet för dem) CO2-innehåll, och insekterna visade ett undvikande svar, som om det fanns en stark lukt av koldioxid bredvid dem. gas.och insekterna uppvisade ett undvikande svar, som om det fanns en stark lukt av koldioxid runt dem.och insekterna uppvisade ett undvikande svar, som om det fanns en stark lukt av koldioxid runt dem.
Med hjälp av fotoaktivering kan information bland annat introduceras i neuroner som de inte fick i verkligheten. Enkelt uttryckt, optogenetik låter dig skapa falska minnen. Detta bevisades av Susumu Tonegawa-teamet från MIT 2013 och använde möss som exempel (Science, 2013, 341, 6144, 387–391, doi: 10.1126 / science.1239073). Forskarna injicerade channelrodopsin-2 i nervcellerna i två regioner i hippocampus som ansvarar för att översätta information från korttidsminne till långtidsminne - dentate gyrus och CA1-fältet. Endast de cellerna märktes med chanelrodopsin, som i preliminära experiment med registrering av elektrisk aktivitet var upphetsade om djuret var rädd för ljud och elektrisk chock i vissa "dekorationer" (de säger också - i ett visst sammanhang). Det är, ursprungligen huskade djuretatt det är värt att vara rädd för ljud i en inställning, men inte nödvändigtvis i en annan. Därefter aktiverades neuronerna med channeledopsin speciellt när djuret befann sig i ett annat "landskap" och i teorin borde inte ha visat rädsla. Under denna procedur frös dock möss i en ny miljö (där de aldrig elektrokuterades) på plats, gömde sig i ett hörn eller gnissade.
Eftersom det visade sig införas i huvudet som djuret aldrig kom ihåg, är det definitivt möjligt att returnera den förlorade informationen. Detta gjordes av anställda vid samma laboratorium två år senare (Science, 2015, 348, 6238, 1007-1013, doi: 10.1126 / science.aaa5542). Först lärde de gnagarna en viss färdighet, sedan sprutade de in dem i hjärnan med proteinsyntesinhibitorer som stör störningen av att komma ihåg nyligen lärt sig (detta har bevisats i många tidigare verk). Det glömda minnet kan emellertid återföras genom optogenetisk aktivering av vissa celler i hippocampus. Vi räknade ut vilka neuroner som måste aktiveras på ungefär samma sätt som i det tidigare arbetet.
Optogenetik och sömn
Optogenetik har också hjälpt till att studera sömn. Det var känt att i de laterala regionerna i hypothalamus finns neuroner som utsöndrar substansen orexin, alias hypocretin. Stabil vakenhet är omöjlig med ett reducerat innehåll av hypocretin i hypotalamus. Om cellerna som utsöndrar det inte är tillräckligt aktiva utvecklar djuret (och personen också) narkolepsi - under vakenhet uppstår plötsliga sömnattacker. Patienten faller antingen helt i sömn, eller så visar han några enskilda tecken på sömn, till exempel en kraftig minskning av muskeltonen eller medvetenhetsförlust. Narkoleptiska anfall kan inte kontrolleras och kan hända i det mest inopportune ögonblicket - säg när en person kör.
Men det kan också vara en slump, och utan ytterligare experiment kan det inte hävdas att det är orexinneuroner som stöder vakenhet. Det var nödvändigt att kontrollera vad som händer med sömnen under deras aktivering. Forskare vid Karl Deisserots laboratorium infogade chanelrodopsin-2 i hypocretinneuronerna från hypotalamus från möss och stimulerade sedan regelbundet gnagarnas hjärnor med ljus medan de sov (Nature, 2007, 450, 420-424, doi: 10.1038 / nature06310). Möss väcktes av denna effekt både i stadiet av långsam vågssömn och vid stadiet av snabbvågsömn. Samtidigt aktiverades orexinneuroner med olika styrkor beroende på hur ofta de lyste. Allt detta tillsammans ger rätt att hävda att frisättning av orexin (hypokretin) i tillräckliga mängder verkligen säkerställer upprätthållandet av vakenheten.
Optogenetik och hjärtat
Optogenetik behöver inte appliceras endast på neuroner, den är lämplig för alla celler som kan upphetsas av elektriska signaler. Förutom neuroner är det hos djur muskelceller, inklusive hjärtmuskeln. Kardiomyocyter måste exciteras synkront, vilket garanterar deras samtidiga sammandragning. Experiment med optogenetisk aktivering av hjärtcellerna från råttaungar, människor och hundar har visat att excitations- och sammandragningsvågorna orsakade av stimulering med blått ljus inte skiljer sig i sina parametrar från de "riktiga" elektriska vågorna (Circulation. Arrytmi och elektrofysiologi, 2011, 4, 5, 753 –760, doi: 10.1161 / CIRCEP.111.964247, Heart Rhythm, 2012, 9, 11, 1910). Dessa arbeten utfördes inte på levande föremål, dock visar resultaten att aktiviteten hos ett sjukt hjärta teoretiskt kan korrigeras med optogenetik.
Optogenetik och psykiatri
Det är förmodligen inte en överdrift att säga att tillämpningen av metoden för optogenetik i psykiatri är ett av Deisseroths huvudsakliga mål, med tanke på hans andra yrke. Det skulle vara bra att först lära sig hur neuroner i hjärnan är anslutna till varandra och sedan stimulera (eller undertrycka) överföringen av signaler mellan de önskade cellerna. Uppgiften är extremt tidskrävande, men teoretiskt genomförbar. Utvecklarna av optogenetikmetoden har gjort flera upptäckter inom detta område. Vissa av dem involverar dopamin-utsöndrande celler. Denna neurotransmitter spelar bland annat en enorm roll för att upprätthålla ett gott humör och ger en känsla av belöning för vad du gör (det sägs att neuroner som släpper dopamin är en del av belöningssystemet). Läkemedel som kokain efterliknar effekterna av dopamin på neuroner,orsakar en känsla av tillfredsställelse. Kroppen kommer ihåg denna känsla och vänjer sig till läkemedlet, psykologiskt och fysiologiskt beroende bildas.
Kärnan accumbens är en del av hjärnans belöningssystem. Om dess dopaminsekreterande celler tillförs halorhodopsin och sedan stimuleras med ljus, "nucleus accumbens" stängs av, och samtidigt försvinner de tidigare utvecklade begär av experimentella råttor för kokain tillfälligt (Nature, 2014, 505, 309-317, doi: 10.1038 / nature12982). Det skulle vara möjligt att göra liknande manipulationer på narkotikamissbrukare, men för detta kommer det att vara nödvändigt att ändra genomet till deras neuroner, vilket ännu inte är tillåtet att göra.
Tillräcklig dopamin skyddar mot vissa former av depression samt Parkinsons sjukdom. Och om optogenetikens bidrag till studien av parkinsonism fortfarande inte är särskilt stort, så försöktes inte gnagarnas depressiva beteende utan framgång att elimineras med fotoaktiverade kanaler (Nature, 2013, 493, 7433, 537-541, doi: 10.1038 / nature11740).
Så i teorin kan optogenetik kasta ljus över alla patologiska tillstånd som är associerade med exciterbara celler. Detta är inte bara drogberoende och narkolepsi, depression och Parkinsons sjukdom, utan också schizofreni, hjärtattacker, ångest, stressstörningar och mycket mer. Hittills är förmågan att behandla dessa villkor med fotoaktiverade kanaler en fråga om teknik och moral. Det är dock möjligt att inom 20–30 år begränsas optogenetikens potential endast av de etiska principerna för forskare och tjänstemän som kontrollerar vetenskaplig forskning.
Svetlana Yastrebova