Genteknik öppnar möjligheter för mänskligheten att skapa tidigare obefintliga organismer och förstörelse av genetiska sjukdomar. Det är dock inte så rosigt eftersom till och med den genombrottande CRISPR / Cas9-tekniken är långt ifrån perfekt. De misstag hon gör kan vara sällsynta, men man räcker för att bli dödlig för en person. Lenta.ru talar om vad som är fel med CRISPR och hur forskare försöker åtgärda situationen.
CRISPR / Cas9-systemet - en slags DNA-sax - anses med rätta vara en revolution inom genteknik. Med hjälp kan forskare redigera det mänskliga genomet, ta bort skadliga mutationer från det och därmed behandla obehagliga och dödliga ärftliga sjukdomar. Man bör dock inte tro att det inte fanns några sådana metoder tidigare. I arsenalen av genetiker var till exempel nukleaser som innehöll zink "fingrar" och endonukleaser - enzymer som bryter DNA-molekyler på specifika platser. När det gäller noggrannhet, mångsidighet och kostnad är de märkbart sämre än CRISPR / Cas9, även om den senare är långt ifrån perfekt.
CRISPR / Cas9 skapades ursprungligen inte av forskare utan av naturen. Det är en molekylär mekanism som finns inuti bakterier och låter dem bekämpa bakteriofager och andra parasiter. I själva verket fungerar det som en immunitet mot infektion. CRISPR (står för "korta palindromiska upprepningar, regelbundet placerade i grupper") är speciella regioner (loci) av DNA. De innehåller korta fragment av DNA-virus som en gång infekterade förfäderna till dagens bakterier men besegrades av deras inre försvar. Dessa bitar kallas distanser och separeras från varandra genom upprepade sekvenser.
När en bakteriofag invaderar en bakterie används varje upprepande sekvens och angränsande distanselement som en mall för syntesen av molekyler som kallas crRNA. Många olika RNA-kedjor bildas, de binder till Cas9-proteinet, vars uppgift är extremt enkel: att skära virusets DNA. Men han kommer att kunna göra detta först efter att crRNA har hittat ett komplementärt fragment av viralt DNA. Efter att Cas9 bryter isär den främmande nukleinsyran förstörs den helt av andra nukleaser.
CRISPR / Cas9 är bra exakt för sin noggrannhet, för för bakterier är immunsystemets korrekta funktion en fråga om liv och död. "Anti-virus" -systemet måste hitta en del av viralt DNA bland en miljon andra och, viktigast av allt, att inte förväxla det med sitt eget genom. Under miljontals år av utveckling har bakterier fulländat denna mekanism. Så strax efter att de tänkt på varför ett CRISPR-system behövdes insåg de att det kunde tämjas som ett aldrig tidigare skådat exakt genredigeringsverktyg.
För att ersätta en specifik region i genomet med en annan är det nödvändigt att syntetisera styr-RNA, vilket i princip liknar crRNA. Hon berättar för Cas9 var det är nödvändigt att göra ett dubbelsträngsbrott i den modifierade organismens DNA. Vi behöver dock inte förstöra genen utan modifiera den - till exempel, byt ut en eller flera nukleotider och ta bort den skadliga mutationen. Här kommer naturen till undsättning igen. Naturliga reparationsmekanismer börjar omedelbart återställa skärkedjan. Tricket är att för att göra detta avlägsnas några RNA-fragment nära pausen, varefter liknande sekvenser sätts in där. Forskare kan ersätta dem med sina egna DNA-sekvenser och därmed modifiera genomet.
Schematisk framställning av CRISPR
Kampanjvideo:
Bild: Kaidor / Wikipedia
Ingenting är dock perfekt. Trots den relativa noggrannheten gör CRISPR-system ibland misstag. En av anledningarna ligger i själva systemets natur. Det är en nackdel för bakterier att crRNA sammanfaller med 100 procent med ett fragment av viralt DNA, som kan skilja sig åt med en eller två nukleotider. Det är bättre för henne att vissa nukleotider kan vara olika, vilket ger mikroorganismen en bättre chans att bekämpa infektionen. Samtidigt hotar låg specificitet inom genetisk teknik fel: förändringar kan göras på fel plats. Om detta händer under experiment på möss finns det ingen speciell tragedi, men redigering av det mänskliga genomet kan förvandlas till en katastrof.
Detta förklarar oro för västerländska forskare om experimenten som utförs i Kina. Asiatiska forskare har använt CRISPR-teknik för att genetiskt modifiera mänskliga embryon. Sådana experiment har förbjudits i Europa och USA, men nyligen har Storbritannien tillåtit dem - enbart för forskningsändamål. Sådana embryon måste förstöras inom några veckor efter mottagandet, vilket utesluter "uppfödning" av genetiskt modifierade människor.
CRISPR / Cas9 skulle dock inte vara så bra om det inte kunde förbättras. Så lärde forskare Cas9 att klippa inte två kedjor samtidigt, utan bara en. Klippet görs på två olika platser i DNA-sekvensen på olika strängar, så systemet måste kunna känna igen dubbelt så många nukleotider som normalt, vilket gör det mer exakt.
Protein Cas och crRNA
Foto: Thomas Splettstoesser / Wikipedia
Forskare vid University of Western Ontario har hittat ett annat sätt att förbättra denna teknik. De försökte lösa problemet med att reparera det skurna DNA: t. Den snabba restaureringen av nukleinsyrakedjan leder till det faktum att forskare inte har tid att göra sina egna korrigeringar av genomet. Således skapas en ond cirkel: kedjan, reparerad på ett oönskat sätt, måste skäras igen med Cas9-proteinet.
För att förhindra att detta händer modifierade forskarna proteinsaxen för att skapa TevCas9-proteinet. Det skär DNA-strängen på två ställen, vilket gör det svårt att reparera platsen. För att syntetisera det nya enzymet tillsattes enzymet I-Tevl till Cas 9, som också är ett endonukleas, det vill säga ett protein som klyver en DNA-molekyl i mitten, snarare än att klyva bort ändarna av sekvensen, som exonukleaser gör. Det resulterande fusionsproteinet visade sig vara mer exakt i bindning till specifika platser och mindre troligt att göra ett misstag och klippa fel plats.
Kristallstruktur av Cas9 bunden till DNA
Foto: Cas9 wiki-projekt / Wikipedia
Det finns ett annat sätt att förbättra noggrannheten i CRISPR-system. "Vapenloppet" mellan bakterier och virus har inte bara lett till utvecklingen av försvarssystem i mikroorganismer utan också till sätt att neutralisera dem. Således muterar bakteriofager snabbt och förlorar de områden genom vilka bakteriell immunitet känner igen dem. Men en del kod för anti-CRISPR-proteiner, som stör krRNA-Cas9-komplexets arbete.
Den 8 december publicerade tidskriften Cell en artikel av forskare från University of Toronto som skapade "anti-CRISPR" - ett system som låter dig stänga av mekanismen under vissa förhållanden. Det förhindrar oönskade fel genom att undertrycka Cas9-aktivitet i händelse av att guide-RNA binder till fel fragment. Anti-CRISPR består av tre proteiner som hämmar nukleas och kodas av generna i ett av bakterievirusen.
CRISPR-teknik används redan för att behandla allvarliga sjukdomar som leukemi och lungcancer och testas också för att rensa hiv från immunceller. När forskare hittar nya sätt att förbättra denna metod öppnas fler och fler möjligheter för dess tillämpning.
Alexander Enikeev
