Ett internationellt team av forskare från USA, Frankrike och Kina har skapat en halvsyntetisk livsform. Även om försök att erhålla bakterier med modifierat DNA redan har gjorts multiplicerades mikroorganismer dåligt, krävde speciella odlingsförhållanden och blev så småningom av med de modifieringar som infördes i dem. "Lenta.ru" berättar om ett nytt arbete där forskare har lyckats lösa dessa problem, efter att ha fått en varelse som skiljer sig radikalt från allt naturligt liv på jorden.
För inte så länge sedan bestod DNA: t av alla levande organismer på vår planet av fyra typer av nukleotider innehållande adenin (A), eller tymin (T), eller guanin (G), eller cytosin ©. Strängar på tiotals eller hundratals miljoner nukleotider bildar separata kromosomer. Generna som finns på kromosomer är i huvudsak långa nukleotidsekvenser i vilka aminosyrasekvenserna för proteiner kodas. Kombinationen av tre på varandra följande nukleotider (kodon eller triplett) motsvarar en av 20 aminosyror. Således använder livet en genetisk kod med tre bokstäver (ATG, CGC och så vidare) baserat på ett alfabet med fyra bokstäver (A, C, T, G).
När en cell i en organism behöver ett protein (polypeptid) slås den gen som kodar för den på. Det senare är fäst vid ett speciellt enzym som kallas RNA-polymeras, som under transkriptionsprocessen börjar följa sekvensen av nukleotider och skapa en kopia av det i form av en molekyl som kallas budbärar-RNA (mRNA). RNA liknar mycket DNA, men i stället för tymin innehåller det uracil (U). Därefter lämnar mRNA cellkärnan och går till ribosomerna, där det fungerar som ett recept för att skapa aminosyrakedjan i proteinet under översättning.
Forskarna bestämde sig för att ändra den genetiska koden för Escherichia coli genom att lägga till ytterligare två "bokstäver" till den. Faktum är att DNA i levande organismer är dubbelt, det vill säga det bildas av två kedjor som är parade med varandra genom komplementära bindningar. Sådana bindningar bildas mellan basen av A-nukleotiden från en sträng och basen av T-nukleotiden från den andra (på liknande sätt mellan C och G). Det är därför de två nya syntetiska nukleotiderna måste kunna para komplementärt. Valet föll på dNaM och d5SICS.
E. coli Escherichia coli
Foto: Rocky Mountain Laboratories / NIAID / NIH
Ett par syntetiska nukleotider infördes i en plasmid - en dubbelsträngad cirkulär DNA-molekyl som kan multiplicera separat från resten av bakteriegenomet. De ersatte ett par komplementära nukleotider A och T, som var en del av laktosoperonen - en uppsättning gener som metaboliserar laktossocker och de icke-kodande DNA-sekvenserna som är associerade med dem. Syntetiska nukleotider inkluderades inte i den region som polymeraset kopierar i mRNA.
Kampanjvideo:
Varför beslutade forskare att inte införa syntetiska nukleotider direkt i genen utan bredvid den? Faktum är att det är mycket svårt att ändra en gen på detta sätt så att den förblir funktionell. När allt kommer omkring måste du binda de resulterande nya kodonerna till vilken aminosyra som helst. För detta är det i sin tur nödvändigt att lära cellen att producera olika typer av transport-RNA (tRNA) som kan känna igen dessa kodoner.
TRNA-molekylerna utför följande funktion. De, som lastbilar, bär en viss aminosyra i ena änden, närmar sig mRNA i ribosomerna och i sin tur börjar matcha tripletten av nukleotider i andra änden med kodonet. Om de matchar, avlägsnas aminosyran och införlivas i proteinet. Men om det inte finns något lämpligt tRNA, kommer inte proteinet att syntetiseras, vilket kan påverka cellens livskraft negativt. Därför måste forskare genom att infoga syntetiska nukleotider i gener skapa gener som kodar för nya tRNA som kan känna igen artificiella kodoner och fästa rätt aminosyra till polypeptiden. Forskarnas uppgift var dock enklare. De behövde se till att plasmiden med syntetiska nukleotider framgångsrikt skulle föröka sig och överföras till dotterorganismer.
Plasmider som används för att transformera Escherichia coli
Bild: Denis A. Malyshev / Kirandeep Dhami / Thomas Lavergne / Tingjian Chen / Nan Dai / Jeremy M. Foster / Ivan R. Correa / Floyd E. Romesberg / Natur / Institutionen för kemi / Scripps Research Institute
Denna plasmid, betecknad pINF, infördes i E. coli. För att kopiera det är det dock nödvändigt att många nukleotider finns i bakteriecellen. För detta ändamål infördes en annan plasmid, pCDF-lb, i E. coli. Den innehöll genen för diatom Phaeodactylum tricornutum PtNTT2, som kodar för NTT-proteinet, som transporterar nukleotider från näringsmediet till cellen.
Men forskare mötte ett antal svårigheter. För det första har proteinerna av Phaeodactylum tricornutum en toxisk effekt på E. coli-cellen. Allt på grund av närvaron i dem av ett fragment av aminosyrasekvensen, som bär en signalfunktion. Tack vare henne tar proteinet rätt position i algcellen, varefter sekvensen tas bort. E. coli kan inte ta bort detta fragment, så forskarna hjälpte henne. De kunde ta bort de första 65 aminosyrorna från NTT. Detta minskade toxiciteten signifikant, även om den också minskade nukleotidtransporthastigheten.
Ett annat problem var att syntetiska nukleotider behölls i plasmider under lång tid och inte ersattes när DNA kopierades. Som det visade sig berodde deras säkerhet på vilka nukleotider som omgav dem. För att ta reda på analyserade forskarna olika kombinationer inbäddade i 16 plasmider. För att förstå om en syntetisk nukleotid hade fallit ur sekvensen använde forskarna CRISPR / Cas9-teknik.
CRISPR / Cas9
Bild: Steve Dixon / Feng Zhang / MIT
CRISPR / Cas9 är en molekylär mekanism som finns inuti bakterier och låter dem bekämpa bakteriofager. Med andra ord representerar denna teknik immunitet mot virusinfektioner. CRISPR är speciella sektioner av DNA. De innehåller korta fragment av DNA-virus som en gång infekterade förfäderna till dagens bakterier men besegrades av deras inre försvar.
När bakteriofagen kommer in i bakterierna används dessa fragment som en mall för syntes av molekyler som kallas crRNA. Många olika RNA-kedjor bildas, de binder till Cas9-proteinet, vars uppgift är att skära virus-DNA. Han kan göra detta först efter att crRNA hittar ett komplementärt fragment av viralt DNA.
Om en RNA-sekvens komplementär till ett visst fragment av plasmiden används istället för crRNA, kommer Cas9 också att skära plasmiden. Men om det finns syntetiska nukleotider i det fragmentet, så fungerar inte proteinet. Med användning av CRISPR är det således möjligt att isolera de plasmider som är resistenta mot oönskade mutationer. Det visade sig att i 13 av 16 plasmider var förlusten av syntetiska nukleotider obetydlig.
Således lyckades forskarna skapa en organism med grundläggande förändringar i DNA, som kunde behålla dem i sig själv på obestämd tid.
Även om en halvsyntetisk livsform bara har två onaturliga nukleotider i sitt genom, som inte finns i kodoner och inte är inblandade i kodningen av aminosyror, är det den första resistenta organismen vars DNA-alfabet består av sex bokstäver. I framtiden kommer forskare sannolikt att kunna använda denna innovation för att syntetisera proteiner och därigenom skapa en fullfjädrad artificiell genetisk kod.
Alexander Enikeev
