Forskare har stora förhoppningar för CRISPR / Cas9-tekniken, som möjliggör högprecisionsförändringar i genomerna hos levande organismer, inklusive människor. Alla nya vetenskapliga artiklar publiceras som beskriver olika typer av CRISPR-system, samt deras modifieringar. "Lenta.ru" berättar om upptäckterna i detta område, som gjordes 2016.
Tusentals av dem
CRISPR / Cas9 är ett bakteriellt adaptivt immunitetssystem som gör det möjligt för mikroorganismer att bekämpa virus. Den består av distanser - DNA-sektioner motsvarande vissa fragment (protospacers) av det smittsamma ämnets DNA. Distansorgan kodar specifika crRNA-molekyler som binder till Cas9-enzymet. Det resulterande komplexet fäster vid virusets DNA-kedja, och Cas9 fungerar som en sax och skär den.
I själva verket är CRISPR / Cas9 bara ett av många liknande system som bakterier och arkea har. Forskare delar upp dem i två klasser. Den första klassen inkluderar CRISPR-system av typ I, III och IV, och den andra - II och V. Typ II innehåller Cas9-proteinet som är involverat i förvärvet av nya distanser, ackumuleringen av crRNA i cellen och DNA-klyvning. I andra system används multiproteinkomplex för dessa ändamål. Detta gör typ II till den enklaste typen av CRISPR-system som är lämplig för genteknikbehov.
Typer kan i sin tur delas in i undertyper beroende på vilka ytterligare gener som är associerade med CRISPR. Till exempel innehåller IIA-system csn2-genen, som kodar för ett protein som binder till DNA och är involverat i förvärvet av distanser. I IIB-system är csn2 frånvarande, men det finns en cas4-gen, vars funktion fortfarande är okänd, och IIC-system har varken csn2 eller cas4.
Skatter inuti bakterier
Kampanjvideo:
Alla kända CRISPR-system har upptäckts av forskare i bakterier som odlas under laboratorieförhållanden. Det finns emellertid ett stort antal okultiverade mikroorganismer, som inkluderar både archaea och bakterier. De lever vanligtvis under extrema förhållanden - mineralkällor eller giftiga vattenkroppar i övergivna gruvor. Men forskare kan isolera DNA från dem och identifiera specifika regioner i det. I ett nytt papper som publicerades i Nature den 22 december avkodade genetiker vid University of California, Berkeley genom från naturliga mikrobiella samhällen och upptäckte andra variationer av CRISPR-systemet.
Bakteriofag - ett virus som infekterar bakterier
Bild: Giovanni Cancemi / Depositphotos
Forskare lyckades ta reda på att vissa typer av lite studerade arke-liknande nanoorganismer ARMAN också har CRISPR / Cas9, även om man tidigare trodde att endast bakterier har dem. Det noteras att detta system upptar en mellanliggande plats mellan undertyperna IIC och IIB och kan tjäna som ett försvar mot parasitiska "hoppande" gener (transposoner) som kommer in i mikroorganismen från andra archaea. Ett försök att reproducera aktiviteten av archaeal CRISPR / Cas9 i E. coli (Escherichia coli) ledde inte till någonting, vilket tyder på att det finns några ytterligare specifika mekanismer som reglerar systemet.
Nya typer av system inom andra klass, CRISPR / CasX och CRISPR / CasY, identifierades också från bakterier som lever i grundvatten och sediment. CRISPR / CasX-systemet inkluderar proteinerna Cas1, Cas2, Cas4 och CasX. Den senare, som visas genom experiment på E. coli, kännetecknas av nukleasaktivitet, det vill säga den kan klyva främmande DNA som Cas9. Detta händer emellertid bara om TTCN-sekvensen är framför protospacers, där N är någon av de fyra nukleotiderna. Sådana sekvenser kallas PAM (protospacer intilliggande motiv - motiv intill protospacer). CRISPR / Cas9-systemet har också sin egen PAM - NGG, som ska placeras efter protospacern. Dessutom kan CRISPR / CasY skära DNA om det finns en TA PAM-sekvens nära målplatsen.
Vad är löftet med denna upptäckt? Faktum är att de upptäckta systemen är de mest kompakta kända för tillfället. Enligt forskare gör den lilla mängden proteiner som krävs för deras arbete CRISPR / CasX och CRISPR / CasY till praktiska verktyg för DNA-redigering. Dessutom kommer metagenomisk forskning, där DNA erhållet från miljön studeras, att avslöja andra typer av CRISPR-system som är användbara för genteknik.
Vägen till excellens
Naturligtvis finns det ett alternativ till sökandet efter CRISPR-system i naturen - förbättringen av den redan existerande CRISPR / Cas9-tekniken. Trots sin höga noggrannhet gör hon misstag genom att skära DNA på fel plats. Detta gör det svårt att göra korrekta förändringar i gener och därför effektivt behandla ärftliga sjukdomar. Därför letar forskare efter sätt att förbättra systemets prestanda. Under 2016 har många vetenskapliga arbeten ägnats åt att modifiera CRISPR och göra det till olika genverktyg.
Protein Cas9 och crRNA - huvudkomponenterna i CRISPR-systemet
Bild: Steve Dixon / Feng Zhang / MIT
Så den 8 december publicerade tidskriften Cell en artikel av forskare från University of Toronto, som skapade "anti-CRISPR" - ett system som stänger av mekanismen under vissa förhållanden. Detta låter dig undertrycka Cas9-aktivitet om guide-RNA binder till fel fragment och förhindrar fel. Anti-CRISPR består av tre nukleashämmande proteiner. Naturligtvis uppfanns det ursprungligen inte av forskare utan av virus, vilket således neutraliserade bakteriernas immunitet.
I juni bekräftade amerikanska forskare tillsammans med kollegor från Ryssland att CRISPR / C2c2-systemet, som erhållits från fusobacterium Leptotrichia shahii, kan skära enkelsträngat RNA. Som ett resultat kan CRISPR-systemet användas för att slå ut - undertrycka funktioner - av budbärar-RNA, som bär information från gener till ribosomer, där proteiner syntetiseras på grundval.
I maj skapade forskare vid University of California CRISPR-EZ-tekniken, som gör att nya DNA-molekyler kan införas i genomet hos musembryon med nästan hundra procents framgång. CRISPR / Cas9-systemet introduceras i befruktade djurägg med en mikroskopisk nål och en liten elektrisk urladdning. I sitt experiment lyckades forskare införa en mutation i genen hos 88 procent av mössen. Detta överstiger antalet genetiskt modifierade möss som produceras genom CRISPR-redigering, som använder konventionella injektioner.
I april, med en mutant variant av Cas9 som saknar nukleasaktivitet, utvecklade molekylärbiologer vid University of Massachusetts School of Medicine CRISPRainbow-teknologin. Guiden RNA, som anger var enzymerna binder, innehöll fluorescerande märkningar, vilket gör det till exempel möjligt att spåra rörelsen av mobila genetiska element.
Anopheles-myggan kan vara det första offret för CRISPR-system
Foto: Jim Gathany / Wikipedia
Modig ny värld
Forskare använder redan CRISPR-system för att skapa genetiskt modifierade organismer, såsom malariamyggor, som sprider skadliga gener bland sina vilda släktingar. Denna metod kallas gendrift. Om en av föräldrarna till en individ var bärare av en mutantgen, kommer han att överföra den till sina avkommor med 50 procents sannolikhet. Detta beror på att föräldern har två kopior av genen, och endast en av dem är defekt. CRISPR kan kopiera ett mutantfragment och infoga det i en frisk gen. Som ett resultat får avkommorna en mutation med 100% sannolikhet.
År 2016 godkände experter från den rekombinanta DNA-rådgivande kommittén (RAC) en ansökan från University of Pennsylvania för att genomföra tester på human genetisk modifiering med CRISPR / Cas9-teknik.
De blev dock förbi av kineserna. I november rapporterade tidskriften Nature att kinesiska forskare för första gången introducerade celler med gener som modifierats av CRISPR / Cas9-systemet till människor. Forskarna extraherade immunceller (T-lymfocyter) från blodet hos en patient med metastaserad lungcancer och använde sedan CRISPR-teknik för att stänga av genen som kodar för PD-1-proteinet. Den senare har visat sig undertrycka immunitet genom att främja tumörtillväxt. Forskare odlade de redigerade cellerna, ökade antalet och injicerade dem sedan tillbaka i människokroppen. Om genterapi klarar sjukdomen återstår att se.
CRISPR-system kan också användas för att bekämpa HIV och ärftliga sjukdomar. Ytterligare forskning krävs dock för att utveckla effektiva behandlingar. Naturligtvis talar vi inte om mutanter, som i science fiction-filmer, men forskare kommer snabbt att kunna skapa genetiskt modifierade organismer, såsom jordbruksväxter med resistens mot parasiter. Det återstår att se varför forskarna som upptäckte CRISPR och räknat ut hur det skulle kunna användas ännu inte har vunnit Nobelpriset.
Alexander Enikeev
